Composti fenolici. Basta fai da te. Utilizziamo i metodi suggeriti dal Coi

Nel mondo olivicolo hanno molti nomi. C’è chi li chiama polifenoli, chi biofenoli, altri più genericamente composti fenolici o alcuni, scendendo nel dettaglio chimico, ortodifenoli.
Molti sinonimi per un unico dato presente sempre più spesso sulle etichette degli oli extra vergini d’oliva.
Il vero problema è tuttavia l’attendibilità del numero indicato perché, in mancanza di metodi d’analisi ufficiali, ogni laboratorio, o quasi, ha il proprio standard e i risultati risultano spesso non confrontabili, con variazioni anche del 50%.

Si tratta di una questione che, per fortuna, non è ancora giunta all’orecchio del consumatore.
Sarebbe altrimenti un’ulteriore perdita di credibilità per un settore che non può sopportare ulteriori danni d’immagine né lo merita.

Occorre quindi uno sforzo d’uniformazione, già perché dei metodi “semi-ufficiali” d’analisi esistono già. Sono stati raccomandati dal Consiglio Oleicolo Internazionale nel 2006 (risoluzione 4/94-V/06) ma la loro diffusione è ancora insufficiente.

Due i metodi proposti.
L’uno, sicuramente molto preciso, ma anche più costoso, è quello proposto dalla Commissione tecnica italiana SSOG definito “determinazione dei biofenoli degli oli d’oliva mediante HPLC”
L’altro è sicuramente alla portata di tutti i laboratori ed è il metodo di Arturo Cert anche detto “metodo colorimetrico per la determinazione di composti ortodifenolici negli oli d’oliva”

Di seguito illustriamo nel dettaglio il procedimento del metodo colorimetrico, in allegato, invece, quello HPLC.

Metodo colorimetrico

1.- Materiali
Materiale per l'estrazione in fase solida (SPE)
Cartucce in fase diol-bonded da 6 mL (0,5g) (Waters o simili)
Filtro per siringa in acetato di cellulosa (0.45 -μdi diametro dei pori), Alltech,
Scharlab o simili
Evaporatore rotativo sotto vuoto
Spettrofotometro UV-vis a λ=370 nm, con cuvette di quarzo con 10.0 mm di
traiettoria.

2.- Solventi e reagenti
Metanolo per spettrometria UV
Etanolo per spettrometria UV
Sodio molibdato diidrato (Merck o simili)
Catecolo (pirocatecolo) (Aldrich o simili)

3.- Isolamento dell'estratto fenolico
Diluire un campione di olio d’oliva (6±0.001 g) in 6 mL di esano.
Sistemare una cartuccia diol-bonded da 6-mL in un apparecchio per l'eluizione sotto vuoto e condizionarla mediante il passaggio consecutivo di 9 ml di metanolo e di 9 ml di esano. Interrompere il vuoto per evitare l'essiccamento della colonna.
Si deposita nella colonna la soluzione di olio e si fa passare attraverso la cartuccia. Si lava il contenitore del campione con due porzioni di esano da 4-ml fuoriuscite dalla cartuccia. Si lava nuovamente il contenitore del campione con 3 ml di miscela esano/acetato di etile (90:10, v/v) fuoriusciti dalla cartuccia e scartati. In seguito, si sistema un matraccio conico da 25-mL e si eluisce la colonna con 15 ml di metanolo. Si fa evaporare il solvente fino a secchezza a temperatura ambiente in un evaporatore rotante. Si riprendere il residuo in 5 mL di soluzione metanolo/acqua (1:1).

4.- Determinazione spettrofotometrica
Mediante una pipetta munita di filtro per siringa in acetato di cellulosa, prelevare 2mL di soluzione fenolica e travasarli in una provetta di vetro. Aggiungere 0,5 mL di una soluzione al 5% di sodio molibdato diidrato in etanolo/acqua (1:1), e agitare la miscela. Dopo 15 min misurare l'assorbanza a λ=370 nm. L'assorbanza della soluzione 2 fenolica è corretta con l'assorbanza di un bianco costituito miscelando 2 mL della soluzione fenolica con 0.5 mL di etanolo/acqua (1:1).
Costruire una retta di taratura (concentrazione, espressa in millimoli/mL, vs assorbanza) misurando soluzioni di catecolo in metanolo/acqua (1:1) in base alla procedura sopra descritta. Preparare soluzioni di catecolo nel range 0.03 – 0.09 mg/mL.
Le soluzioni devono essere preparate di fresco e protette dall'esposizione alla luce.
Per il range di assorbanza 0.2 - 0.8, soluzioni di catecolo, idrossitirosolo e idrossitirosolo acetato hanno dato la seguente equazione:
Concentrazione di o-difenoli (mmol/mL) = (0.452 + 10.318 * ABS) * 10-4
Dove ABS = assorbanza della soluzione fenolica – assorbanza del bianco
Se l'assorbanza della soluzione fenolica è superiore a 0.8 è necessario ottenere un nuovo estratto fenolico e diluirlo in 10 mL di metanolo/acqua (1:1) invece che in in 5 mL. Una alternativa è l'estrazione da 3 g di olio.
Se l'assorbanza della soluzione fenolica è inferiore a 0.2, gli estratti fenolici di due o più cartucce devono essere combinati e diluiti in 5 mL di metanolo/acqua (1:1). Usando una sola cartuccia, la concentrazione minima determinata è 0.26 mmol/kg di olio.

5.- Calcoli
La concentrazione di o-difenoli negli oli, espressa in millimoli/kg, si calcola secondo la formula
[C] nell'olio (mmol/kg) = (Cextr * 2.5 * Vextr * 1000) / 2 * Woil
Dove:
Cextr (mmol/mL) = concentrazione nell'estratto calcolata mediante applicazione
dell'assorbanza alla retta di taratura
2.5 = volume (mL) della miscela di reazione
Vextr = volume totale (mL) della soluzione dell'estratto
2 = Volume (mL) di soluzione dell'estratto impiegato per questa reazione.
Woil = peso (g) del campione di olio.
I risultati devono essere espressi in millimoli di o-difenoli/Kg di olio.