L’Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare (EFSA) ha pubblicato nel 2012 un parere scientifico relativo ai potenziali rischi per la salute derivanti dall’ingestione di idrocarburi di olio minerale (MOH). Questi contaminanti possono avere origini molto diverse: materiali di imballaggio, coadiuvanti tecnologici, lubrificanti per macchinari o contaminazione ambientale. All’interno della famiglia MOH si distinguono due frazioni principali. I MOSH (idrocarburi saturi) sono costituiti da paraffine e nafteni; hanno una tendenza ad accumularsi nel fegato e nei linfonodi. I MOAH (idrocarburi aromatici) includono composti policiclici alchilati e sono considerati i più preoccupanti, poiché alcuni di essi possono agire come mutageni e cancerogeni. La raccomandazione UE 2017/84 ha quindi invitato gli Stati membri a monitorare la presenza di queste sostanze negli alimenti, in particolare negli oli e grassi vegetali. Non esistendo ancora limiti armonizzati a livello europeo, alcuni paesi (come la Germania) hanno stabilito limiti nazionali, ad esempio 0,5 mg/kg per i MOAH.
Il problema principale per i laboratori di controllo è che i metodi più affidabili per la determinazione di MOSH e MOAH sono spesso on-line, basati sull’accoppiamento HPLC-GC, e richiedono strumentazione avanzata e costosa. Per questo motivo, presso la raffineria Qorteba Internacional S.L. (Córdoba, Spagna) è stato avviato un progetto volto a sviluppare e ottimizzare un metodo off-line, utilizzando la gascromatografia con rivelatore a ionizzazione di fiamma (GC-FID) già presente in laboratorio. L’obiettivo era di ottenere risultati comparabili con quelli dei metodi di validazione, pur mantenendo un protocollo adatto alle analisi di routine.
Materiali, metodi e procedure di ottimizzazione
Sono stati confrontati tre metodi analitici descritti in letteratura. Il metodo 1 è quello proposto dal Consiglio Oleicolo Internazionale (COI) e prevede due fasi cromatografiche successive: una prima colonna solo con silice attivata per ottenere una “massa lavoro”, e una seconda colonna con due strati di silice e silice al 10% di nitrato d’argento. Il metodo 2, sviluppato da Sulpasso (Chemiservice s.r.l., 2016), utilizza un’unica colonna con due fasi: silice e silice/AgNO₃ al 10%. Il metodo 3 è stato elaborato internamente da Qorteba, basandosi su un protocollo del Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), con un’unica colonna contenente silice/AgNO₃ allo 0,3%. Per tutti i metodi, dopo la separazione e l’eluizione delle frazioni, si aggiunge toluene per evitare la perdita di volatili, si evapora fino a circa 300 µl e si inietta manualmente 0,5 µl nel gascromatografo (Perkin Elmer Autosystem XL) con iniettore on-column, colonna TRB-1HT (15 m, 0,32 mm DI, 0,10 µm film) e detector FID. La quantificazione avviene mediante standard interni: cicloesilcicloesano (CYCY) per i MOSH e 1-metilnaftalene (1MN) per i MOAH, con integrazione manuale dei cromatogrammi per separare i picchi degli idrocarburi naturali (n-alcani) dal cosiddetto “hump” dei composti di origine minerale.
La fase di ottimizzazione è stata condotta inizialmente senza campioni reali, utilizzando un multipatrone di standard MOSH/MOAH. Per il metodo 1 si è osservato che nella prima colonna (solo silice) rimanevano trattenuti alcuni composti aromatici come 1MN e 2MN, anche aumentando il volume di n-esano da 40 a 60 ml. Solo utilizzando una miscela più polare (n-esano, diclorometano e toluene) è stato possibile eluirli completamente. Questa complessità ha portato a escludere il metodo 1 per le analisi di routine. Per il metodo 2, l’ottimizzazione ha richiesto una riduzione del volume di eluizione per la frazione MOSH (da circa 18 ml a 12,5 ml di n-esano) e l’aumento del volume per la frazione MOAH (fino a 40 ml di miscela binaria n-esano/diclorometano 75:25). In questo modo si è evitata la contaminazione della frazione satura con standard aromatici (come il pentilbenzene, TBB e perilene). Per il metodo 3, caratterizzato da una minore concentrazione di nitrato d’argento, si è dovuto ridurre il volume di eluizione della frazione MOSH a 5,8 ml (di cui 3,8 ml di n-esano e 2 ml di miscela ternaria) e aumentare a 12,5 ml la miscela ternaria per i MOAH, per recuperare completamente il perilene che tendeva a rimanere adsorbito sulla colonna.
Confronto dei risultati e discussione
I tre metodi ottimizzati sono stati applicati a tre campioni di olio d’oliva di diversa qualità: un olio extra vergine (AOVE), un olio vergine (AOV) e un olio raffinato (REF). I risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti da laboratori accreditati esterni (metodo di validazione) e con i metodi “attuali” del laboratorio per la determinazione degli idrocarburi alifatici (HA, simili ai MOSH) e degli idrocarburi policiclici aromatici (IPA, simili ai MOAH). Nel campione AOVE, i metodi 2 e 3 hanno fornito risultati molto prossimi tra loro per la frazione MOSH (2,20 ppm per il metodo 2 e 2,19 ppm per il metodo 3), mentre il metodo di validazione indicava 25,20 ppm – una discrepanza notevole, probabilmente dovuta alla diversa integrazione dell’hump e alla sottrazione dei picchi naturali. Per i MOAH, il metodo di validazione riportava <1 ppm, mentre il metodo 2 dava <1 ppm e il metodo 3 3,16 ppm. Nel campione AOV, il metodo di validazione ha quantificato MOSH totali in 6,30 ppm; il metodo 2 ha dato 2,19 ppm e il metodo 3 2,18 ppm. Per i MOAH in AOV, il metodo 3 ha sovrastimato (7,26 ppm) rispetto al metodo di validazione (<1 ppm). Nel campione raffinato (REF), le differenze si sono fatte più marcate: il metodo di validazione ha trovato 7,50 ppm di MOSH, mentre il metodo 2 ha rilevato 3,48 ppm e il metodo 3 addirittura 4,60 ppm di MOAH (il metodo di validazione dava <1 ppm). Globalmente, il metodo 2 (silice/AgNO₃ al 10%) ha fornito risultati più vicini a quelli dei laboratori accreditati, soprattutto per la frazione satura. Questo è spiegabile con la maggiore capacità della fase al 10% di nitrato d’argento di trattenere le interferenze polari e gli olefini, garantendo una separazione più netta tra i MOSH e i MOAH. Tale osservazione è in accordo con studi precedenti di Moret et al. (2011, 2012). Il metodo 3, pur essendo più semplice e rapido nella preparazione delle colonne, ha mostrato una tendenza a sovrastimare i MOAH, probabilmente a causa di una minore ritenzione dei composti aromatici nella colonna cromatografica. Dal punto di vista operativo, il metodo 2 richiede una preparazione più accurata della silice con nitrato d’argento al 10% e tempi più lunghi, ma garantisce una maggiore affidabilità dei risultati. Il metodo 3 potrebbe essere utile come screening preliminare, ma necessita di ulteriori affinamenti per la corretta quantificazione dei MOAH in matrici complesse come gli oli raffinati.
Conclusioni e prospettive per i laboratori di controllo
L’attività di ricerca condotta presso Qorteba Internacional S.L. ha dimostrato che è possibile sviluppare un metodo off-line per l’analisi di MOSH e MOAH in olio d’oliva utilizzando una comune gascromatografia con FID e una preparazione delle colonne a fase solida con silice/nitrato d’argento al 10% (metodo 2). Sebbene i risultati quantitativi non coincidano perfettamente con quelli dei metodi di validazione, il metodo ottimizzato ha mostrato una buona ripetibilità e una chiara capacità di separazione delle due frazioni, come confermato dai test con standard e dai cromatogrammi. Un punto critico fondamentale rimane l’integrazione manuale dei cromatogrammi, che introduce una certa soggettività nella sottrazione dell’hump di origine minerale dai picchi degli idrocarburi naturali (n-alcani e squalene). Questo limite è tipico dei metodi off-line e richiede operatori esperti. Dal punto di vista pratico, l’adozione del metodo 2 all’interno del laboratorio di una raffineria di olio d’oliva è fattibile, a patto di dedicare tempo alla formazione del personale e alla standardizzazione delle procedure di integrazione. La possibilità di monitorare internamente i livelli di MOSH e MOAH, anche in assenza di limiti di legge armonizzati, rappresenta un valore aggiunto in termini di controllo qualità e sicurezza alimentare, consentendo di identificare eventuali fonti di contaminazione nella filiera produttiva. In prospettiva, si auspica che la futura normativa europea fissi limiti ufficiali e fornisca metodi di riferimento più semplici e accessibili, ma nel frattempo l’approccio off-line descritto costituisce una valida soluzione per i laboratori che non dispongono di strumentazione HPLC-GC. Il lavoro ha inoltre permesso di trasferire competenze operative al personale di Qorteba, migliorando la preparazione complessiva del laboratorio in vista dei controlli sempre più stringenti su questi contaminanti emergenti.
