L'arca olearia 21/01/2022

La virulenza del batterio Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi che causa la rogna dell'olivo

La virulenza del batterio Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi che causa la rogna dell'olivo

Una tesi finalista alla borsa di studio Giorgio Fazari ha dimostrato che l’ingresso del Ca2+ è un evento iniziale indispensabile per l’avvio del processo infettivo batterico


Tra le malattie biotiche che colpiscono l’olivo vi è la rogna dell’olivo che, diffusa in tutti gli areali di coltivazione della specie, determina perdite più o meno gravi nella produzione di olive.

L’agente causale della rogna dell’olivo è il batterio Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (da qui in avanti: Psav) il quale porta alla formazione di tumori (detti tubercoli) prevalentemente sui giovani rami e sulle branche. La patogenicità e la virulenza del batterio dipendono da fitormoni, sistema di secrezione di tipo III, c-di-GMP, regione WHOP, Quorum Sensing e altri fattori. Recentemente è stato dimostrato che anche variazioni del Ca2+ citosolico influenzano la virulenza di Psav. Il batterio, infatti, per permettere l’ingresso del Ca2+ extracellulare nella sua cellula, sfrutta uno scambiatore Na+/Ca2+, codificato dal gene cneA nel ceppo DAPP-PG 722 di Psav. Il Ca2+ agisce quindi da segnale esterno ed è determinante per l’avvio della trascrizione dei geni batterici collegati alla patogenicità e virulenza in olivo. Il mutante ottenuto per il gene cneA di Psav non è infatti in grado di causare la formazione del tubercolo in piante di olivo di 1 anno di età della cultivar Frantoio e di indurre reazioni d’ipersensibilità in tabacco.

Le colture in vitro e quindi l’utilizzo di plantule vitro-derivate sono un valido strumento per studiare l’interazione tra batteri e piante arboree, riducendo i tempi per la comparsa dei sintomi nonché lo spazio necessario allo stoccaggio del materiale.

Pertanto, lo scopo di questa tesi è stato mettere a punto la tecnica per l’ottenimento in vitro di plantule di olivo ‘Frantoio’ e dimostrare che anche nel patosistema Psav/plantule di olivo il Ca2+ gioca un ruolo importante nella virulenza del batterio.

Sono stati prelevati getti dell’anno da piante in vaso di olivo cultivar Frantoio di circa 5 anni di età. Da questi sono state isolate talee uninodali di circa 1 cm di lunghezza che dopo essere state disinfettate sono state posizionate in substrato del tipo Olive Medium a metà concentrazione delle sue componenti (fase di stabilizzazione) (Figura 1).

Figura 1. Fase di stabilizzazione. Da talea uninodale posizionata sul substrato all’ottenimento di espianto uninodale (visualizzazione da sinistra verso destra).

Con gli espianti ottenuti è stata avviata la fase di proliferazione per ottenere germogli di 5-8 cm da destinare alla fase di radicazione. La base dei germogli è stata dunque mantenuta per tre giorni al buio in immersione in soluzione acquosa contenente IBA (acido indol-3-butirrico) e saccarosio al fine di portare a termine l’induzione rizogena. I germogli sono stati quindi posizionati su substrato agarizzato dove, dopo circa 21 giorni, si è assistito alla formazione delle radici. Alle plantule così ottenute è stata rimossa una foglia intermedia mediante l’uso di un bisturi sterile e in corrispondenza di ciascuna incisione sono stati inoculati 2 µl di sospensione batterica alla concentrazione di 108 ufc ml-1. Gli inoculi sono stati fatti con il ceppo wild type di Psav DAPP-PG 722, con il mutante per lo scambiatore Na+/Ca2+ (Psav-cneA) e con acqua come controllo negativo.

Figura 2. Evoluzione dei sintomi della malattia in plantule vitro-derivate della cultivar Frantoio inoculate con 108 ufc ml-1 di Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi DAPP-PG 722

La presenza di sintomatologia sulle plantule è stata valutata dopo 7, 14, 21 e 35 giorni dalla data di inoculo. Nelle plantule inoculate con il ceppo Psav DAPP-PG 722 wild type si osservavano al ventunesimo giorno necrosi e rigonfiamento dei tessuti al di sotto del punto di inoculo che hanno portato alla fessurazione del fusticino al trentacinquesimo giorno (Figura 3) mentre nelle plantule inoculate con il mutante Psav-cneA come in quelle inoculate con acqua non è stato osservato alcun sintomo (Figura 4).

Figura 3. Evoluzione dei sintomi della malattia in plantule vitro-derivate della cultivar Frantoio inoculate con 108 ufc ml-1 di Psav-cneA DAPP-PG 722.

È stata anche osservata la dinamica di crescita della popolazione del ceppo Psav DAPP-PG 722 wild type e del mutante Psav-cneA: mentre le cellule del batterio wild type si moltiplicavano nei giorni successivi alla data di inoculo quelle del mutante non erano in grado di proliferare nelle plantule di olivo micropropagate (Figura 4).

Figura 4. Dinamica di popolazione del ceppo DAPP-PG 722 di Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi e del relativo mutante per lo scambiatore Na+/Ca2+ (Psav-cneA) inoculati in plantule di olivo cv. ‘Frantoio’ micropropagate in vitro

In conclusione, con questo lavoro di tesi è stato confermato che anche in plantule micropropagate di Frantoio l’ingresso del Ca2+ è un evento iniziale indispensabile per l’avvio del processo infettivo batterico. È stato quindi possibile affermare che i due patosistemi: plantule micropropagate – Psav, piante legnose di 1 anno di età – Psav rispondono ugualmente alle variazioni del Ca2+ citosolico.

L’utilizzo di plantule vitro-derivate si è rivelato funzionale e valido al presente studio confermando i vantaggi del sistema: necessità di minori spazi per lo stoccaggio dei vasi e tempi notevolmente ridotti per la manifestazione dei sintomi: al quattordicesimo giorno dall’inoculazione è stato già possibile osservare un rigonfiamento e un principio di necrosi al di sotto del punto di inoculo. Inoltre, per lo studio delle interazioni tra pianta e batterio, il binomio cultivar ‘Frantoio’ – ceppo DAPP-PG 722, mai utilizzato su prove in vitro, è stato particolarmente indicativo in quanto ‘Frantoio’ è una cultivar di importanza locale, estremamente diffusa in Umbria dove è stato isolato (Perugia) tale ceppo.

di Linda Franceschetti