I meccanismi di idrolisi enzimatica dell'oleuropeina nelle olive

L'ulivo, pianta molto nota della specie Olea europaea L., coltivata per la particolare importanza agronomica nei territori del Mediterraneo, come la maggior parte dei componenti la famiglia delle Oleaceae, abbonda in metaboliti minori, reputati secondari, solo perché contenuti in quantità inferiori rispetto ai primari, le proteine, i carboidrati e i lipidi. Mentre, i metaboliti bioattivi, a struttura secoiridoide semplice ed esterificata con la funzionalità biofenolica, rivestono un ruolo notevole nella dinamica del vegetale e dei suoi derivati, l’olio d’uliva, le ulive da mensa e le foglie d’ulivo. In a sostanza, tali biomolecole, derivate dall’apertura del loro scheletro metilciclopentanico con varia sostituzione di gruppi funzionali, contribuiscono alla difesa biomolecolare contro gli erbivori e sono responsabili della resistenza contro un ampio insieme di agenti patogeni infestanti nell’attacco alle Oleaceae.

Con riferimento alle sue drupe, il profilo metabolico della pianta partecipa al gusto dell'olio d'uliva e delle ulive da mensa, con un sapore unico di piccante e di amaro, e, soprattutto, può motivare i suoi effetti sul benessere e sulla salute umani. Tuttavia, la quantità e la composizione dei metaboliti presenti nell’uliva e quindi nell'olio e nelle ulive da mensa, dipendono in gran parte dall'ambiente pedoclimatico per la sua influenza sull'epigenetica della cultivar di uliva impiegata, dallo stadio di maturazione al momento della raccolta, nonché dalla tecnica di lavorazione applicata. Il biofenolo-secoiridoide, seco-BP, più abbondante nell'ulivo è l'oleuropeina, OLE, accumulata fino a 90 mg/g di peso secco nelle foglie e 140 mg/g di peso secco nelle drupe, generata tramite una biosintesi della porzione secoiridoide simile agli altri iridoidi, come la secologanina di stretta correlazione strutturale. Il geraniolo pirofosfato, GPP, precursore del terpenoide, in sequenza viene convertito in acido desossiloganico, intermedio centrale per formare gli oleosidi, con la caratteristica strutturale comune della funzione 8,9-olefinica. La loro esterificazione con i biofenoli, BPs, come il tirosolo, T, nel ligstroside, e l’idrossitirosolo, HT, nell’OLE, origina i metaboliti tipici dell'Olea. L’OLE, uno dei principali bioattivi dell'ulivo, è anche un precursore di una serie di biomolecole idrolitiche e di trasposizione formate dopo la degradazione dei tessuti e delle cellule della drupa d’ulivo, in particolare durante la raccolta e il trattamento al frantoio oleario e la produzione delle ulive da mensa. Mentre le reazioni catalizzate soprattutto dalle perossidasi, POD, e dalle polifenolossidasi, PPO, generano a una serie di pigmenti polimerizzati, una sequenza seriale di reazioni di scissione idrolitica incanala l'OLE verso biomolecole modificate attive in azioni più specifici. In particolare, il legame glucosidico della funzionalità secoiridoide, così come l'estere metilico e l'estere all’HT sono soggetti all'idrolisi enzimatica, catalizzata dalla β-glucosidasi e dalle esterasi.

La dinamica dell’intero processo innesca l'attivazione di inibitori per il sostentamento dei patogeni attaccanti la drupa dell’ulivo e rappresenta, quindi, un meccanismo di difesa immunitaria da parte della pianta, trasmessa in seguito al consumatore di cibo nella tradizione della Cultura Alimentare Mediterraneo-Italica, CAMI, poi Dieta Mediterranea, MeDiet, sin dai tempi delle migrazioni di genti Italiche in terra di Saturnia nel II millennium BCE. Le dialdeidi reattive formate dalla porzione oleosidica dell’OLE e dei suoi analoghi seco-BPs sono coinvolte nella denaturazione delle proteine, un effetto osservato anche per l'alcaloide indolico monoterpenoide, MIA, in stretta correlazione col derivato dalla secologanina, precursore, la strictosidina. L'analisi dei bioattivi terminali della trasformazione biomolecolare è spesso ostacolata dalla forte reattività dell'oleoside aglicone, soprattutto nella sua forma di dialdeide, indotto a generare numerosi metaboliti collaterali. Di grande interesse è anche la dinamica biomolecolare di trasformazione dei vari oleosidi bioattivi dell'ulivo per i loro intrinseci effetti nutrizionali, farmacologici, nutraceutici, cosmeceutici e nutricosmeceutici. L'oleocantale, dialdeide dal ligstroside, ha mostrato le sue funzioni antinfiammatorie e anti-neurodegenerative, in esperimenti di biomimesi, come, inoltre, sono stati segnalati effetti antiproliferativi e antibatterici contro l'Helicobacter pylori, in quanto sono state dimostrate le stesse attività farmacologiche dell'ibuprofene, il farmaco antinfiammatorio non steroideo, NSAR, sulla base del risultato di entrambe le molecole nel inibire la stessa ciclossigenasi, COX, nella biosintesi delle prostaglandine. Tuttavia, la formazione di biomolecole, attive all’interno dei prodotti derivati dalle ulive in alternativa ai farmaci di sintesi, è difficile da gestire in conseguenza delle molteplici variabili da controllare e del meccanismo della dinamica della loro generazione ancora poco prevedibile. Le fitomolecole con strutture di interesse selezionate sono presenti solo in quantità limitate nei vari tessuti vegetali dell’ulivo, da ostacolarne l'isolamento dalle fonti naturali, la drupa e le foglie dell’ulivo. Ad esempio, l’oleaceina dall’OLE e l’oleocantale dal ligstroside sono componenti minori e deperibili presenti nell'olio extra vergine di oliva, EVOO, ottenuto da alcune varietà di uliva, in condizione pedoclimatiche controllate e con processi di produzione al frantoio oleario ben gestiti, ma, comunque, il contenuto di tali metaboliti, ancora limitato, tra 0,002–0,048% e 0,004–0,021%, richiederebbe l'impiego di grandi quantità di risorse alimentari costose e preziose, tale da rendere inadeguata ogni modalità di recupero. Pertanto, per valutare l’efficacia dei metodi biotecnologici, per la produzione mirata di prodotti derivati dall'OLE e dai suoi analoghi seco-BPs selezionati, è necessaria una comprensione più approfondita della dinamica di catalisi nel controllo del processo verso la generazione dei bioattivi agenti sul benessere e sulla salute del consumatore dei prodotti dell’ulivicoltura di CAMI. È stata caratterizzata l'idrolasi attiva sul legame β-glucosidico dell'OLE, mentre, per le due potenziali reazioni di scissione della funzionalità estere, è stato osservato il coinvolgimento enzimatico in diverse fasi dello sviluppo della pianta o della lavorazione del prodotto dall'uliva e, come catalizzatori rilevanti, in precedenza non ancora determinati, sono state identificate e descritte quattro metilesterasi della famiglia delle α/ß-idrolasi, due preposte alla scissione degli esteri metilici degli agliconi oleosidici.

La rimozione del sapore amaro dalle ulive naturali, per renderle commestibili in ulive da mensa, dipende pure dall'idrolisi dell'OLE e dei suoi omologhi seco-BPs, tramite un processo della durata di un paio di settimane a diversi mesi, a seconda della tecnologia adottata. Un'analisi approfondita dei singoli BPs e seco-BPs, per 19 molecole e oltre contenute nelle drupe di ulivo di Olea europaea, eseguita sulle diverse cultivar, deamaricate con i metodi Oinotrio, Greco, Spagnolo e di Castelvetrano, considerati nell'intero processo di deamarizzazione con diversi tempi di campionamento nell'arco di alcuni mesi, dimostra i differenti approcci tecnologici produrre BPs e seco-BPs in quantità e qualità simili, anche se attraverso intermedi e vie cataboliche diverse. Inoltre, i risultati sperimentali indicano la pratica di conservazione adottata per le ulive di Castelvetrano nella salamoia di fermentazione per il tempo di fermentazione necessario a un impiego commerciale redditizio, può in potenza determinare nelle ulive la degradazione di maggiori quantità dei diversi metaboliti originari dell'OLE, come l’HT, l’oleoside, l’oleoside 11-metil estere e il glucosilmetil oleoside. Queste ulive vengono raccolte da fine settembre prima della loro maturazione, quando ancora la polpa presenta una consistenza croccante e le drupe mantengono un colore verde brillante. Dalla forma tondeggiante e dalla polpa soda, le ulive di Castelvetrano sono caratterizzate dall’avere un gusto dolce con una leggera sapidità. Le drupe selezionale vengono trattate a pH elevato con una soluzione di soda per alcune ore e, in seguito, subiscono ripetuti lavaggi per eliminare la soluzione di soda residua. Quindi, vengono immerse nella salamoia di una soluzione di acqua e di sale marino e rimangono a fermentare per 3-4 mesi, quando sono pronte per il confezionamento e il consumo o per le successive lavorazioni di denocciolatura o di rondellatura.

Le foglie di ulivo sono attualmente considerate un materiale di scarto nell’uliveto e nel frantoio, nonostante abbiano un grande potenziale per essere trasformate in sottoprodotti grazie al loro elevato contenuto di OLE. L'OLE è un precursore glicosidico dell'idrossitirosolo, HT, il biofenolo, BP, con la più alta capacità antiossidante in natura associato a molteplici benefici per la salute. Per questo motivo, la domanda di OLE risulta crescente nei settori farmaceutico, cosmetico e alimentare. L'obiettivo è determinare la stabilità dell'OLE nelle foglie di ulivo nell’uliveto e nel frantoio in forma solida e acquosa in diverse condizioni di temperatura, umidità relativa e illuminazione. I risultati indicano la trasformazione biomolecolare dell'OLE conforme alla cinetica di primo ordine, con le costanti di velocità alle temperature testate negli estratti acquosi indicative di energie di attivazione da RT l a 80 °C e da 7 °C a 14 °C, poiché le reazioni di conversione erano diverse in questi intervalli. Inoltre, la polvere di foglie di ulivo conservata a qualsiasi temperatura con un'UR ≥ 57% ha mostrato una maggiore stabilità dopo sei mesi, con un risultato incoraggiante per lo stoccaggio e la trasformazione di tale scarto nell’uliveto e nel frantoio oleario.

Le foglie di ulivo dell’Olea europaea L. e i sottoprodotti del frantoio oleario sono ancora considerati uno scarto da smaltire nella filiera asimmetrica dall'uliveto al frantoio, soprattutto in considerazione dei lavori di potatura e di manutenzione negli uliveti e della trasformazione di processo dall’uliva all’olio d’uliva. Durante la stagione della potatura, possono essere raccolte 1,5-3 t/anno/ha di foglie, mentre il peso delle foglie in un frantoio oleario varia da circa 0,075 a 0,15 t/anno/ha. Nella tradizione, sono sottoprodotti di scarto, bruciati o impiegati per la mangimistica animale, mentre le foglie d’ulivo sono ricche di bio- e di poli-fenoli, bioattivi con effetti benefici sulla salute umana e con un loro potenziale di destinazione come materie prime seconde per i settori della farmaceutica, della cosmeceutica, della nutricosmeceutica e dell’agroalimentare d’identità territoriale. Il loro beneficio per la salute umana è attribuito alla composizione in bioattivi, soprattutto all’OLE, la più abbondante, e, in misura minore, al ligstroside, ai derivati dell'acido idrossicinnamico, come il verbascoside, agli alcoli biofenolici liberi, come l’HT e il tirosolo, e ai flavonoidi, come l'apigenina-7-O-glucoside e la diosmetina-7-O-glucoside. L'OLE, glucoside tra la biomolecola dell’oleoside-11-metilestere, esterificata all'HT, tramite un legame estereo, e mediante un legame glucosidico all’aglicone e a una molecola di glucosio, entrambi idrolizzabili in differenti condizioni e con specifici meccanismi molecolari di processo. Pertanto, a seguito di idrolisi enzimatica, catalizzata da specifiche esterasi, rilascia, come precursore più adatto, l’HT e l’acido-11-oleosidico. Infatti, processi biosintetici nell’uliva, attivati verso la formazione di derivati naturali vegetali durante la trasformazione in olio d’uliva e in ulive da mensa, sono sequenze enzimatiche di solito orchestrate con rigore e con il coinvolgimento di numerosi biocatalizzatori specializzati. Dopo il loro accumulo nelle cellule e nei tessuti vegetali delle foglie e della drupa dell’ulivo, alcune fitomolecole, altrimenti non reattive, possono essere elicitate per via enzimatica, ad esempio in risposta a minacce ambientali, come l'attacco di patogeni, così da generare i bioattivi presenti nell’olio extravergine di oliva, OEVO, e nelle ulive da mensa, le maccate e le squalate d’Oinotrìa, tramite il processo di conservazione delle ulive nere di antica tradizione divenuta identità territoriale delle genti Oinotrie. Nell'uliva dell’Olea europaea, i BPs derivati dai secoiridoidi, come l'OLE o il ligstroside, possono essere convertiti dalle glucosidasi e dalle esterasi tissutali, non sempre identificate, in aldeidoleosidi, non solo coinvolti nella difesa dai patogeni, ma anche di elevato potenziale nelle applicazioni come prodotti farmaceutici, nutraceutici, cosmeceutici e nutricosmeceutici.

Tramite i risultati delle ricerche sperimentali ottenuti mediante le applicazioni della genomica disponibili sulle ulive, quattro nuove metilesterasi hanno mostrato una significativa omologia con la polineuridina aldeide esterasi, PNAE, di Rauvolfia serpentina, un enzima attivo su un gruppo di metaboliti monoterpeno-indolo alcaloidi, MIA, correlati solo in parte, ma anche con la presenza di una struttura secoiridoide 1. I quattro enzimi delle ulive appartengono alla famiglia della specie α/ß-idrolasi e hanno mostrato un'attività variabile in vitro contro gli esteri metilici di ormoni vegetali selezionati, vale a dire l’acido jasmonico, MeJA, l’acido indolacetico, MeIAA, e l’acido salicilico, MeSA. Nessuno dei catalizzatori enzimatici identificati era in attività diretta sui metaboliti delle ulive, l’OLE, il ligstroside o l’oleoside 11-metil estere. Tuttavia, quando impiegati in una reazione sequenziale con una glucosidasi appropriata, due erano in grado di idrolizzare questi iniziali idroliti specializzati e generare le dialdeidi reattive. Pertanto, le esterasi sperimentate svolgono un ruolo fondamentale nell'attivazione dei biofenoli secoiridoidi dell'uliva, insieme con le diverse metilesterasi valutate, di concomitante capacità di transesterificazione in vitro, una caratteristica innovativa capace di generare esteri etilici dell'acido jasmonico, JA, o dell'acido indolo-3-acetico, IAA.

Fondamentale, conseguente all’azione della β-glucosidasi, risulta l’elicitazione l’ampia gamma di bioattivi a struttura biofenol-secoiridoide, aperta alla funzionalità metilciclopentano e sostituita con vari gruppi iperattivi, impiegati nei processi biotici, farmacologici e nutraceutici, cosmeceutici e nutricosmeceutici. Le proprietà antiossidanti dei bioattivi primari e dei sottoprodotti dell'ulivo sono state provate con precisione e hanno dimostrato l'OLE e l'HT in particolare potenti antagonisti nel ripulire e nello spazzare via l'anione superossido e le altre specie reattive all’O e all’N. L'HT, considerato l’antiossidante più potente dopo l'acido gallico e uno tra i più efficaci bioattivi antiossidanti, insieme con gli altri biofenoli di natura derivata dalla struttura secoiridoide  oleuropeinica, tramite la sua elevata capacità antiossidante, è un potenziale agente terapeutico, antitrombotico, cardioprotettivo, antitumorale, microbicida e antinfiammatorio. Inoltre, un claim salutistico dell'Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare, relativo ai biofenoli liberi e secoiridoidi dell'olio d'uliva, invoca un loro contributo nella protezione dei lipidi del sangue dallo stress ossidativo. Tali potenzialità hanno suscitato grande interesse da parte del settore farmaceutico, cosmetico e alimentare. L'OLE, l'HT, l’idrossitirosil-elenolato e gli altri bioattivi delle foglie di ulivo, solubili in acqua, conferiscono all’ulivicoltura e ai frantoi un grande potenziale per ottenere estratti acquosi ricchi di fitomolecole originarie e di idroliti loro derivati, passibili di trasmutare gli scarti in un prodotto secondo, anche in forma solida da destinare al settore degli integratori alimentari e della nutri- e cosme-ceutica.

L'effetto dell'EVOO e dei suoi ingredienti biofenolici, OOBPs, sul panorama epigenetico esaminato con sistematica valutazione dei dati sui componenti del modello alimentare tradizionale nella CAMI, divenuta razionale prescrizione con la MeDiet, può indurre mutazioni epigenetiche attraverso la metilazione del DNA, la modifica degli istoni e la regolazione dei microRNA, miRNA. La ricerca sulla regolazione epigenetica, indotta dall’applicazione del modello della CAMI, può fornire informazioni sulle ricerche predittive e mettere a punto linee guida sulla gestione della salute pubblica, come evidenziato dalla ricerca bibliografica eseguita sui database PubMed, Scopus e Web of Science e all’analisi delle prove sperimentali pubblicate. Dopo aver applicato criteri di selezione, ad esempio l'inclusione di ricerche biomimetiche, animali o umane integrate con EVOO o i suoi OOBPs, sono stati esaminati accuratamente 51 articoli scientifici e la valutazione della qualità è stata asseverata tramite l’impiego dello strumento Cochrane, rivisto per il rischio di bias. I risultati mostrano EVOO e i suoi OOBPs potenziali promotori di modifiche epigenetiche in grado di regolare l’espressione di geni e di bersagli molecolari coinvolti in diversi processi metabolici. Ad esempio, l’OLE può essere un regolatore epigenetico nel cancro e l’HT modulare l’espressione dei miRNA coinvolti nello sviluppo del cancro, delle patologie cardiovascolari e neurodegenerative. EVOO e i suoi OOBPs possono regolare l'espressione genica e modificarne i meccanismi epigenetici influenti sulla fisiopatologia umana. Una delucidazione completa, relativa agli effetti epigenetici dell'EVOO e dei suoi OOBPs, può contribuire allo sviluppo di diverse strategie farmaco-nutrizionali per valorizzarli come agenti epigenetici, come annotato nel Registro prospettico internazionale delle revisioni sistematiche, PROSPERO, CRD42022320316. Adv Nutr 2022; 13:2039-2060.

Infatti, chiarire gli effetti epigenetici dell'EVOO e dei suoi OOBPs può contribuire a identificare e a sviluppare diverse strategie farmaco-nutrizionali incentrate sull'impiego di questi bioattivi come agenti epigenetici. La regolazione di diversi meccanismi epigenetici, coinvolti in molti settori biologici, è dimostrata e sintetizzata in numerose ricerche sperimentali e teoriche. I risultati esaminati mostrano l'adesione al modello CAMI e alla MeDiet, insieme con un consumo regolare di EVOO, dei suoi OOBPs e dei suoi secoiridoidi-OOBPs, potenziale prevenzione allo sviluppo di alcune patologie croniche, come il cancro o le affezioni cardiovascolari, attraverso meccanismi epigenetici. Naturalmente, sono necessarie ulteriori ricerche tramite l’impiego di modelli biomimetici appropriati e, soprattutto, in vivo per chiarire gli effetti epigenetici di EVOO e dei suoi OOBPs e il loro potenziale ruolo futuro come agenti terapeutici aggiuntivi e integrativi.

La ricerca sperimentale e meccanicistica può offrire soluzioni adeguate per programmare l’impiego dei bioattivi contenuti nella foglia d’ulivo e nei derivati del processo produttivo dell’OEVO, tramite la corretta valutazione della loro evoluzione biomolecolare quando trasformati in un prodotto secondo nell’uliveto e nel frantoio ulivicolo e conservati per le più varie destinazioni d’impiego salutistico. Pertanto, l’obiettivo della ricerca sperimentale e biomimetica, eseguita tramite la formulazione della sequenza reattiva derivata dalle applicazioni del calcolo, mira a determinare la stabilità e la dinamica molecolare del modello oleuropeina nelle foglie di ulivo e nel processo di trasformazione agroindustriale eseguito nel frantoio oleario nella sequenza della frangitura, della gramola, della separazione nel decanter e della filtrazione dell’originario olio d’uliva in forma di velato, un novello di elevata ed eccezionale qualità edonico-sensoriale e salutistica, di liquido,  in emulsione lipido-acquosa, solida in diverse condizioni di pH, di temperatura, di umidità relativa e di esposizione alle radiazioni luminose.